Die Quellen des Río Negro liegen im südöstlichen Kolumbien im Einzugsgebiet des Río Guainía im Südwesten des Berglands von Guyana. Nördlich des Äquators fließt er anfangs in südöstlicher Richtung und vereinigt sich mit dem vom Río Orinoco abzweigenden Rio Casiquiare. Wenige Kilometer oberhalb der Ortschaft São Gabriel da Cachoeira, wo es zahlreiche Stromschnellen (portugiesisch Cachoeira) gibt, kreuzt der Fluss schließlich den Äquator, biegt dann nach Osten ab und mündet weiter südlich unterhalb von Manaus in den Amazonas. Im Anavilhanas-Archipel hat der Rio Negro eine Breite von ungefähr 27 Kilometern.